二、研究方法
2.1 实验对象
实验在三只狨猴身上进行：两只雌性（实验对象 B：420 克，11 岁；实验对象 M：350 克，4 岁）和一只雄性（实验对象 R：400 克，4 岁）。所有三个实验对象都是在作者之一自 1996 年以来在约翰霍普金斯医学院饲养的群落中出生和长大的。实验程序经约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会评估和批准，符合美国国立卫生研究院的指导方针。
2.2 头柱和记录室的设计
小脑浦肯野细胞的记录对稳定性有特殊要求：不仅需要分离神经元，还需要通过简单和复杂尖峰的出现确定该神经元的身份，这就需要移动电极和较长的记录时间。插入胶水的金属柱连接到固定在灵长类动物椅子上的杆上，从而将头部固定在一个位置上。最近的一种方法是一种类似光环的装置，将头骨固定在一个环内。这两种方法都用于大脑皮层的记录。然而，到达小脑需要打开头骨后部的通道，这使得光环方法不太可取。此外，我们的目标是制造一种能减少对下层皮肤和肌肉破坏的方法，从而设计出一种既能使皮肤覆盖头骨，又能使颞肌保持完整的方法。这促使我们开发了一种基于钛合金的头部支柱和腔室设计，该设计无需使用丙烯酸头盔，并最大限度地扩大了颅骨后部的开放区域（图 1）。
图 1. 头部支柱和底腔的设计。A：术前计算机断层扫描（Pre-Operation CT）图像，我们用它来建立头骨表面的几何模型。B：与基于 CT 的动物头骨模型相匹配的头部支柱和底腔模型。螺钉、头部支柱和腔室均为钛金属。C：头部支柱（2.39 克），其设计精确地适合受试者的弯曲几何形状。D：基腔（0.48 克）。
为了做好头部固定的准备工作，我们根据每个受试者头骨表面的特定几何形状设计了头部支柱，并使用三维打印（3D）钛制造。我们从术前 CT（图 1A）开始，利用它建立头骨的三维模型（图 1B）。这项工作是通过开源图像分析和可视化软件 3D Slicer 完成的。然后将三维头骨模型导入计算机辅助设计（CAD）环境，从而设计出 X 形钛合金头柱（图 1，B 和 C）、钛合金底座记录室（图 1D）和塑料保护室盖。头柱和底座腔体的设计经过优化，不仅重量轻，而且不受额眼脊和颅骨外侧脊的解剖限制，使我们能够最大限度地减少对颞肌附件的损伤。头部支柱和基底腔室是用激光熔化的 5 级钛金属（6AI-4V；Sculpteo）3D 打印而成，重量轻（3 克）、生物相容性好、耐腐蚀。覆盖腔室的保护帽是用聚乳酸（PLA）塑料长丝（0.5 克）3D 打印而成的。
2.3 手术
头柱和腔室的植入手术由实验室成员领导的外科小组进行，兽医技术员和兽医提供协助。用阿法沙龙（12 毫克/千克）麻醉动物，然后用 2.0 号无套气管插管（ET），注射异氟醚（1-1.25%，根据需要调整）以维持麻醉平面，并通过肌肉注射（IM）阿托品和地塞米松。然后，将双侧耳杆插入骨性耳道，固定在立体定向框架上，再将咬合杆与前额钳连接滑动到位，以确保头部相对于胸部的位置适当且稳固，从而固定受试者的头部。然后在头皮下的皮下空间注射利多卡因（2%）和肾上腺素（1:100,000），用稀释的洗必泰与酒精交替循环处理手术区域，最后喷洒倍他丁。接着，我们用手术记号笔在头皮上画出中线切口的轮廓，切口向眶上脂肪垫后方延伸 2 毫米，一直延伸到枕骨脊。然后，我们用手术刀进行切口，将皮肤与下层筋膜以及筋膜与下层肌肉分离。在此基础上，使用刮匙和 3% 过氧化氢溶液去除残留组织，准备颅骨表面，然后定位头部支柱，准备植入。
2.4 为小脑建立基于舱室的坐标系统。
由于头骨和腔室设计的尺寸较小，我们发现很难在头柱上安装微型机械手。由于微型机械手在头柱外部，我们担心可能无法准确瞄准并重复接近小脑中的理想位置。这促使我们设计了一个电极引导系统，并将其集成到腔室设计中（图 2 和图 3）。我们的问题是，在手术过程中，基底腔是用手放在头骨上的，因此不知道它相对于小脑的位置。此外，手术后对植入动物进行 CT 或 MRI 成像是可能的，但也存在问题，因为钛片会产生大量伪影，使基底腔难以精确定位。
图 2. 开发基于腔室的几何模型，以确定电极轨迹和毛刺孔的位置。A：术前核磁共振成像图像，用于确定小脑中的目标区域。B：术后计算机断层扫描（CT）成像前插入基底腔的参考轴尺（1.104 克）。C：手术安装头部支柱、基底腔和参考尺后的术后 CT 图像。虽然参考尺清晰可见，但钛头柱和底腔产生了明显的伪影。D：术前 CT、术后 CT 和术前 MRI 的核心对比图。标记用于识别参考轴上的点和小脑中的点。标记表示毛刺孔位置。E：将头骨、小脑、腔室和参考标尺进行核心注册的三维（3D）模型。F：利用三维模型，我们绘制了以小脑中的兴趣点为起点，汇聚到头骨上一个直径为 1.5 毫米的毛刺孔，然后在引导工具内以圆柱体的形式向腔室外发散的轨迹。这些轨迹代表了所需的电极路径。
图 3. 电极轨迹引导工具的设计。A：对准工具的设计目的是沿着汇聚到不同小脑目的地的 20 条所需轨迹中的每一条轨迹精确放置电极。该工具由一个三维打印块（2.03 克）组成，每个所需的电极轨迹都有一个圆柱体。图中所示为该工具的模型，其中有 20 个引导圆柱，这些圆柱与感兴趣的记录区域对齐，并通过单个开颅毛刺孔汇聚在一起。B：导筒轨迹与小脑记录范围的后视图和矢状图。标签标明轨迹所指向的小脑小叶。C：将电极与所需轨迹对准。我们将对准工具安装在基底室中，然后将一根杆放入与所需轨迹相对应的圆柱体中（右图为对准工具的剖面图）。然后，我们将一根管子放入电极支架（也就是后来用来固定电极的支架），并将电极支架连接到微型驱动器上。然后用微型机械手操纵微型驱动器，使夹持管子的微型驱动器的运动轴与杆对准。D：电极和电极支架对准以沿着所需的轨迹前进的图像。
2.5 设计电极导向工具。
根据我们在术后模型中定义的电极轨迹（图 2F），我们设计了一种工具，将其安装在基底腔上，使电极对准特定轨迹，穿过毛刺孔，到达所需的小脑兴趣点（图 3A）。这种对准工具有 20 个圆柱形轨迹，每个圆柱直径为 1/32 英寸。所有圆柱体都汇聚到一个毛刺孔上，然后轨迹发散，到达不同的小脑目的地。20 个圆柱体（图 3B，“引导圆柱体”）被配置成 4 × 5 的网格，与四个目标小脑小叶（VIIa、VIa-c、VIe 和 Vd）相对应，沿中线-侧轴的跨度为 0 至 2.5 毫米。对准工具中的圆柱体提供了毛刺孔上方电极轨迹的物理表示。该工具使用 Objet260 打印机和 VeroClear 塑料丝进行 3D 打印。
2.6 数据采集
我们使用三种电极记录小脑数据：石英绝缘四纤维（四极）或七纤维（七极）金属芯（铂/钨 95/05）电极和 64 触点高密度硅探针。这些电极都无法穿透狨猴硬脑膜。因此，我们使用 30 号针头进行了微型硬膜切开术，该针头安装在立体定向显微机械手框架上，并推进到硬膜表面，直至穿刺。穿刺完成后，各种电极就可以穿过硬脑膜。
如图 4 所示，我们将每个电极连接到 32 或 64 通道头台放大器和数字转换器（Intan Technologies），然后将头台连接到通信系统（RHD2000；Intan Technologies）。此外，我们还将定制行为软件的数字输出和安装在显示器屏幕上的光学传感器的模拟输出连接到 RHD2000 系统。
图 4. 行为和电生理记录系统。AcB：采集板；BC：行为计算机；EC：眼部记录计算机；EpC：电生理计算机。
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2.7 行为训练
在早期的猕猴研究中，我们发现解码眼动蚓部普肯列细胞活动的一个关键步骤是将它们组织成组，组内的所有细胞对视觉误差具有相同的偏好。对错误的偏好是通过细胞的复合尖峰调谐发出信号的，当动物做出一个囊回时可以测量到，但在囊回结束时目标并不在眼窝上，这就产生了一个感官预测错误，我们将其表示为一个向量。当普金杰细胞根据其依赖于误差的复合尖峰调谐进行组织时，每个群体都会以增益场的形式实时预测眼球在囊回过程中的运动。因此，我们对狨猴进行了一项任务训练，在这项任务中，我们可以识别每个浦肯野细胞与视觉误差相关的复合尖峰调谐。
手术恢复后，我们立即让狨猴食用食物调节饮食。在每周 5 天的时间里，这种饮食包括在 30 克水中混合 15 克实验室饮食粉和 10 克苹果/芒果酱。这样，我们就能在任务期间通过注射泵为动物提供净重 40 毫升的可输送食物。周末期间，第一天和第二天的食物分别为 30 克和 25 克实验室固体食物。为了确保动物的健康，我们每天都会对动物的体重进行监测：体重保持在食物调节制度实施前平均体重的 85%-100%。如果体重低于 85%，则停止食物调节，在群落中喂养动物，直到体重恢复到至少 90%。动物会逐渐适应由饲养员抱着，独立进入运输车，坐在任务椅上。实验室温保持在 74-84 华氏度。以每周 5 天的频率进行眨眼训练。
三、研究结果
通过上述方法，我们可以训练受试者在小脑记录过程中每次产生约 1,000 次试验。然而，我们是在经过多次失败尝试的学习过程后才掌握这些方法的。下面我们将从这两种结果的角度来介绍我们的经验。
3.1 行为结果。
对于受试者 B，我们使用一个宽松的头枕系统，在没有头枕的情况下进行了囊跳训练实验（图 5A，第 -416 至 0 天）。经过多次尝试后，我们放弃了这种方法，因为我们无法进行稳健的校准。
图 5 .食物调节后的体重模式和正确试验次数。A：受试者 B 的体重（蓝色）和正确试验次数（红色）记录。训练开始时没有头柱，但由于无法对眼睛的测量结果进行可靠的校准而未能成功。手术后，在没有食物调节的情况下进行了很长一段时间的训练，但最终因动物不愿进行超过几百次的试验而放弃。食物调节后，动物的任务表现显著提高。B：实验对象 M 的体重和正确试验数据；C：实验对象 R 的体重和正确试验数据。绿色阴影表示食物调节期。黄色阴影表示食物调节和神经电生理记录期间。
我们在实验对象 R 身上尝试了一种不同的囊状移动训练方法。我们没有从定点训练开始，而是进行了为期 3 天的追逐训练。该受试者的良好表现让我们得以在随后进行了 15 次囊回任务训练，在此期间只出现主目标，幅度从 3°逐渐增加到 5°。然后，我们又对该受试者进行了主任务训练，在此期间，主目标位于 6°，次目标位于 2.5°。图 6C 中的正确试验次数从第一天的主要囊回训练开始，随着受试者进入主要任务的训练而持续增加。在食物调节后的 2 个月内，该受试者能够在主要任务中完成 1,000 至 1,500 次正确试验。
我们的目的是在一项任务中对受试者进行训练，在这项任务中，我们可以测量Purkinje细胞对控制囊视的贡献。每次试验以 200 毫秒的中心位置固定开始，然后向位移 5° 或 6° 的外围目标（y）进行一次主要的囊状移动，向位移 2° 或 2.5° 的次要目标进行纠正囊状移动，并在次要目标处进行 200 毫秒的固定（图 5A）。图 5B 中绘制的是一次有代表性训练的囊状移动，图 5C 中绘制的是反应时间的分布。受试者 M 和 R 的主要囊回反应时间分别为 188 ± 65 毫秒和 197 ± 69 毫秒（平均值 ± 标准差）。受试者 M 和 R 的矫正囊回反应时间分别为 146 ± 50 毫秒和 169 ± 50 毫秒。为了量化囊回的准确性，我们测量了囊回终点与目标中心之间的距离，发现对于主要囊回，受试者 M 的距离为 0.59 ± 0.35°，受试者 R 的距离为 0.85 ± 0.50°（图 5D）。对于校正囊回，M 受试者与目标的距离为 0.34 ± 0.22°，R 受试者为 0.49 ± 0.32°。因此，在这两个被试中，分别有 81% （1,251 次中的 1,011 次）和 88% （1,672 次中的 1,464 次）的试验是以向目标的主要回扫开始的，并正确结束和获得奖励。
3.2 同时记录成对的浦肯野细胞。
我们使用四极、七极和高密度硅阵列对小脑第五、第六和第七小叶进行了探索。我们原以为头颅接地螺钉将为我们的电生理记录提供参考。然而，根据对受试者 M 的经验，我们了解到接地螺钉是不必要的：在神经电生理记录过程中，头柱本身就可以作为电信号的可靠参考。这可能是因为钛螺钉在头柱和骨头之间建立了电气连续性。因此，对于受试者 R，我们在手术过程中取消了接地螺钉。
当电极接近触角时，背景活动明显增加，这表明电极接近普肯耶细胞，而且它们的基线放电率很高。当电极穿过触球时，出现明显的 “啪 ”声，随后尖峰活动逐渐增加。
图 6. 狨猴小脑的记录。A：硅阵列、四极管和七极管记录的复杂和简单尖峰。红色星号表示复杂尖峰。B：七极管同时记录多个神经元的例子。黑色迹线为高通滤波电压，红色迹线为同一信号的低通滤波版本（300 赫兹截止）。顶部和底部轨迹为假定的浦肯野细胞；中间轨迹为不明的第三神经元。C：尖峰触发波形和直方图。在上图中，七叶单触点记录的电压由同一触点上的复合尖峰触发。由此产生的复合尖峰触发波形呈现出先简单尖峰后复合尖峰，然后简单尖峰抑制的统一模式。这种模式被量化为 Pr[S(t)|C(0)]，即在 0 时出现复合尖峰的情况下，在 t 时出现简单尖峰的概率。由此产生的简单尖峰触发波形表现出对称的尖峰抑制期，反映了浦肯野细胞的折射期。这种模式被量化为 Pr[S(t)|S(0)]。Prob.，概率。
我们通过条件概率 Pr[S(t)|C(0)]对这一模式进行量化，它测量的是在 0 时出现复合尖峰的情况下，在 t 时出现简单尖峰的概率。这一测量结果表明，在复合尖峰之前，简单尖峰以相同频率出现，但在复合尖峰之后的约 10 毫秒内，简单尖峰被完全抑制。
浦肯野细胞的第二个特征是简单尖峰的折返期很短。利用简单尖峰触发电压波形可以验证这一特征。图 7C 的底部轨迹就是一个例子。我们通过条件概率 Pr[S(t)|S(0)]对这一模式进行量化，该概率测量的是在 0 时出现简单尖峰的情况下，在 t 时出现简单尖峰的概率。
图 7显示了在执行囊闪任务时同时记录到的第七小叶神经元的两个例子。在图 8A 中，七叶分离出三个神经元，其中两个是浦肯野细胞。在该试验中，动物在水平轴上看到一个 5° 的目标，并在 220 毫秒的潜伏期内做出一个囊闪。在囊回开始时，目标会被擦除，然后沿垂直轴位移 2°重新绘制。因此，在垂直囊回结束时，目标并不在眼窝上，从而产生视觉错误，促使动物进行垂直囊回纠正。这是跨轴适应的一个例子。囊回落在距离目标约 0.5° 的地方，随后是一个纠正囊回。触点 6上的浦肯野细胞在主要囊回之前产生了一个复杂的尖峰。第二个普肯涅细胞记录在触点 5 上，它在主要囊回开始之前没有产生复合尖峰，而是在经历视觉错误之后（纠正囊回开始之前）产生了复合尖峰。触点 7 分离出第三个神经元，但该神经元不是普金杰细胞，因为它没有复合尖峰。
图 7. 在两次囊回任务中记录的七叶神经元示例。A：样本试验，显示触点 5 上的一个普肯耶细胞、触点 6 上的另一个普肯耶细胞和触点 7 上的一个不明神经元的活动。黑色迹线为高通滤波电压，红色迹线为低通滤波信号（300 赫兹截止）。插图显示了七节点的几何形状和每个触点的位置。B：从 A 节段记录的尖峰波形和尖峰计时模式。CS 表示复杂尖峰，SS 表示简单尖峰，ISI 表示尖峰间期。Pr[S(t)|S(0)]是在 0 时出现简单尖峰的情况下，在 t 时出现简单尖峰的概率。Pr[S(t)|C(0)]是在 0 时出现复杂尖峰的情况下，t 时出现简单尖峰的概率。C：在不同时段记录的试验样本，显示触点 7 上的一个浦肯野细胞、触点 1 上的另一个浦肯野细胞以及触点 4 上的一个不明神经元的活动。D: 在 C 片段中记录的尖峰波形和尖峰计时模式。条件概率的间隔大小为 1 毫秒，复杂尖峰 ISI 的概率为 200 毫秒，简单尖峰 ISI 的概率为 2 毫秒。尖峰波形上的误差条为 SD。Prob.，概率。
3.3 同时记录的浦肯野细胞的尖峰计时特性。
同时记录多个浦肯野细胞的能力使我们能够探究附近的细胞是否协调其活动，这种功能可能是驱动小脑核神经元的基本要素。然而，由于存在多个触点，在触点 A 上记录并归因于浦肯野细胞 1 的一些尖峰实际上是由附近的浦肯野细胞 2 产生的，而触点 B 也记录了这些尖峰。防止这种错误归因的方法之一是比较尖峰触发的波形。
图 8A（左）显示了触点 6 在与图 8A 所示相同的会话中记录的简单尖峰波形。图 10A 中部显示的是触点 6 记录的波形，但由触点 5 上的简单尖峰触发。数据表明，平均而言，触点 6 记录的电压仅在很小程度上反映了触点 5 记录的尖峰。偶尔，两个浦肯野细胞会在 1 毫秒内产生一个简单的尖峰。因此，这些特征表明，这两个触点的数据中出现的任何协调活动都是因为两个独立的细胞在大致相同的时间内发射了简单的尖峰。
图 8 .一对同时记录到的浦肯野细胞在囊状移动任务中的尖峰计时特性。A：一个浦肯野细胞被触点 5 隔离，另一个被触点 6 隔离。触点 6（上）记录的数据由触点 6（左）上的简单尖峰事件和触点 5（中）上的简单尖峰事件触发；右边的数据由触点 6 记录，如果触点 6 和触点 5 在 1 毫秒内同时出现简单尖峰事件，则触发数据。底部显示的是触点 5 的波形。平均而言，一个触点上的尖峰不会在另一个触点上产生明显的电压变化，同步（1 毫秒内）和非同步尖峰的形状几乎相同。B：为了测量浦肯野细胞之间的协调性，我们通过触点 5 上的尖峰触发触点 6 上的波形。协调模式通过条件概率 Pr[S6(t)|S5(0)]量化。C，左图：当另一通道在 0 时出现复杂尖峰时，在 t 时出现简单尖峰的概率，用 Pr[S5(t)|C6(0)] 和 Pr[S6(t)|C5(0)] 量化。复杂尖峰之后没有简单尖峰抑制。右图：复杂尖峰同时出现的概率 Pr[C5(t)|C6(0)]。两个细胞没有产生强烈协调的复杂尖峰。Prob.，概率。
图 8C 右侧显示的条件概率 Pr[C5(t)|C6(0)]量化了触点 5 和 6 上复合尖峰之间的关系。该图表明，这两个浦肯野细胞中的复合尖峰没有很好地协调（0 毫秒潜伏期时很少或没有共同出现）。总之，这对同时记录的浦肯野细胞（细胞之间的距离可能小于 50 μm）的数据表明，这两个细胞并非由同一个下橄榄神经元提供服务。然而，简单尖峰表现出一定程度的协调，表明它们可能共享共同输入，或者一个细胞的电活动影响了另一个细胞的活动。
四、研究讨论
虽然狨猴作为灵长类动物模型在研究社交行为、语言交流和眼球回旋运动的神经控制方面具有许多吸引人的特点，但人们对狨猴是否能被激励产生足够数量的试验表示担忧。之前关于头束缚狨猴的报告显示，它们在听觉任务以及眼动任务中表现出操作性条件行为。然而，性能一直是一个令人担忧的问题：听觉任务中每节课约 100 次试验，囊回任务中每节课 80-100 次试验，眼动任务中每节课 300-800 次试验。在本研究中，我们的目标是改进这些结果，并发现通过行为训练方案，可以激励动物每次持续进行 ~1,000 次试验。
此外，为了研究运动学习的神经基础，我们的目标是构建能够对小脑进行神经生理学研究的工具。我们从基于 CT 和 MRI 的受试者头骨几何模型入手，利用这些数据计算 3D 打印钛合金头柱和腔室底部的曲率。利用成像数据，我们设计了一种对准工具，该工具带有圆柱体，可通过绝对编码器微型驱动器引导电极穿过毛刺孔。这样就能在完成囊闪任务时对多个普肯耶细胞进行稳定记录。
在之前的报告中，每次试验的奖励量相对较大：每次试验 0.1-0.2 毫升、每次试验 0.07 毫升或每次试验 0.05-0.06 毫升。在本研究中，我们训练受试者期望较低的奖励率，即每次试验 0.02 毫升。成功试验的声音和食物泵的啮合表明食物已经送出，但低奖励率鼓励受试者等待三次或更多次正确试验后再收获累积的食物。这种低奖励率可能是促使受试者在每次训练中持续进行相对较多的试验的一个重要因素。我们通过取消定点训练，转而从追逐训练开始，大大缩短了受试者 R 的训练时间，发现仅在几天后就可以开始进行囊跳任务训练，并在开始食物调节后的 1.5 个月内完成约 1,000 次正确试验。
我们发现，使用现代电极可以在目标引导的囊视过程中从蚓部分离出多个Purkinje细胞，据我们所知，这在灵长类动物中仅有过一次报道。我们对四极、七极和高密度硅阵列进行了实验，发现它们各有优势。四极和七极具有三维几何形状，可以记录同一叶内的多个浦肯野细胞，而硅阵列则可以记录跨叶的浦肯野细胞。在我们手中，七叶虫的三维几何形状提供了一种强大的能力，可以从成对的浦肯野细胞中例行分离并稳定地保持记录。这些细胞通常具有共同的重要功能特性，如复杂的尖峰调谐和简单的尖峰协调。
我们还发现，在其他动物中用于识别浦肯野细胞的计算工具在狨猴身上也能很好地发挥作用。与其他动物一样，狨猴普肯涅细胞中的复杂尖峰波形表现出缓慢的动态性，因此可以使用基于频率的过滤技术来初步区分复杂尖峰和简单尖峰。此外，在复杂尖峰之后，会有 10 到 15 毫秒的简单尖峰抑制期，这有助于确认是单个浦肯野细胞产生了这两个尖峰。
最后，我们能够同时记录成对的浦肯野细胞，并观察到它们在时间上的亚毫秒级协调。Purkinje细胞群可以协调它们的尖峰突触，这种协调可能在调节小脑深核神经元的活动中发挥关键作用。贝尔和格林最早证明了简单的尖峰协调，他们在麻醉猫体内进行微电极记录时发现，相距小于 70 μm 的浦肯野细胞经常几乎同时发射。后来的研究发现了支持这一观点的更多证据。例如，科学家证实，在大鼠身上，几百微米范围内的浦肯野细胞在伸手抓取食物颗粒期间会同步发射，但在抓取完成后则不会。
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